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为什么说基于磁力柱的细胞分选才是更优化的细胞分选手段?!

2021-03-29 11:01:40 admin 1

基于偶联有特异性识别抗体的磁珠,使细胞在经过磁场时得到分离,这就是细胞磁性分选的基本原理。这一方法因为灵敏度高、操作便捷,特别是所得细胞的活力高,更满足下游更多的复杂应用,因此受到越来越多研究人员的青睐。


原来,小小磁力分选蕴藏大学问
你是否真的明白?
今天就让小编为你详细道来。


 

Positive Selection vs. Negative Isolation


阳性选择(Positive Selection)指通过使用抗体偶联磁珠标记目的细胞,令其滞留在磁场中;将分离柱移除磁场后,洗脱得到有标记的目的细胞。过程示意如下图所示:

 

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阴性分离(Negative Isolation)是通过将所有非目的细胞使用抗体偶联磁珠标记后,令其滞留在磁场中,此时从分离柱中流穿的部分就是未经标记的目的细胞,过程示意图如下:


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关于 Column-based selection


所谓 Column-based cell selection, 就是通俗所说的「有柱式」分选,即被磁性标记的细胞需要流经一个置于磁场内的分离柱从而实现对目的细胞分离的过程。这个分离柱内由高度均一的微小铁珠构成,其作用是将磁场吸引力放大 10,000 倍,这样就达到目的细胞只需要极微量的磁珠标记,即可被滞留于磁场中并得到分离的目的。


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那么为什么要强调极少量的磁性标记(Minimal Labeling)呢,这对于细胞分选有什么优势?
简而言之,优势有二:节约表位和回收率高

节约表位——对于低丰度或弱表达的细胞表面标记物而言,表现得更为突出。由于该类型标记物的表达数量本身就少,极少量的标记意味着只有少部分的表面位点被磁珠占用,仍有很多的空余位点可被其他识别抗体标记,以进行如流式细胞分析用。比如我们需要对 PBMC 中的 CD4+T 细胞进行富集分选时,若使用了 CD4 磁珠标记并配合柱式分选后,可直接使用 CD4-PE 的流式抗体孵育后进行流式分析,比如确认富集后的目的细胞纯度和回收率(Recovery);但如果是采用非柱式分选,则需要通过加大磁珠的标记量以达到增加磁力以保证 CD4+ 细胞被充分滞留于磁场中 (记得前面我们说过,有柱/无柱的磁场强度相差 1 万倍哦),这样在进行后续标记时,就必须选用其它 CD Marker 以进行流式分析,因为此时 T 细胞表面所有的 CD4 Epitope 都已经被磁珠占据而无法进行抗体结合。

一图读懂有柱式分选时 Minimal Labeling 的意义:


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回收率高——通过将所有非目的细胞进行磁性标记后去除的策略中(Negative isolation),无柱分选的弊病在于,由于磁场强度有限,为了充分标记所有非目的细胞,磁珠会过度标记包括目的细胞在内的所有细胞,导致从磁场中流穿的目的细胞并非真正的「无标记」。这一点很容易得到证明:取这样获得的「无标记细胞」流穿一次分离柱然后洗脱,就可以发现流穿液中包含不少存在磁性标记的细胞。


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上图所示分别为使用有柱式(A)和无柱式(B)对单核细胞进行阴性分选后,将收集得到的目的细胞悬液进行免疫荧光染色,以确认残余的磁珠含量。可见(B)图中,大量绿色葡聚糖磁珠依然残存,表明所得细胞并非完全「无标记」。

此外,由于这种非特异过度标记的发生,会导致细胞的回收率大幅降低。细胞回收率的高低,在对含量较低的目的细胞群体进行无标记分离时则至关重要。比如在造血干细胞移植治疗白血病的临床应用中,除有效富集 CD34+ 细胞的同时,还需要充分去除供体移植物内的 αβ T 细胞,只保留 γδ T 细胞;但健康供者体内 γδ T 细胞含量只有 5% 不到,目的细胞回收率的低下可能导致因移植物内免疫效力低而治疗失败的后果。与此同时,对于细胞的过度标记,使细胞表面形成团块,可能对分离后细胞的下游分析造成不良影响:


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磁珠的大小


当前市售标准化磁珠产品按直径大小可粗略划分为微米级磁珠和纳米级磁珠。微米级磁珠直径在 1.3-4.5 mm 不等,这些大磁珠通常会引起较强的细胞激活作用,所以微米级磁珠在特定细胞类型的激活研究中有较好表现。需要特别说明的是,以 T 细胞激活应用为例,大磁珠带来较强细胞激活、较快细胞扩增速度等优点的同时,T 细胞会较早出现耗竭等被认为与激活过快相关的副作用。所以在扩增速度和细胞质量之间,需要研究人员加以权衡考量。

与大磁珠对应的就是以 MACS 磁珠为代表的纳米级小磁珠,这类磁珠的直径在 50 nm 左右,且形成极度均一的胶体结构。从实际操作和实验结果来看,胶体的好处就是微珠始终均匀分布,无需任何涡旋或震荡,只需吸取推荐的体积数即可, 保证了实验的准确性和高度可重复性。

 

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基于磁珠的细胞分选方法已被大量推荐并应用于当前前沿科研应用,如单细胞转录组测序中,因为使用纳米级磁珠分选细胞的过程极温和,且特异性极高,与技术运行及下游测序有很好的兼容性,并被主流技术平台所官方推荐,如顶顶有名的死细胞去除试剂盒(Dead cell removal kit),因其适用于多种需提升单细胞样品质量的应用,如单细胞测序样本制备、原代细胞培养、细胞复苏后去除死细胞等。