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新冠研究中光片整体成像技术的应用

2021-04-26 15:03 admin

对于当前仍波及全球的 COVID-19,大量研究信息,如病毒的作用受体及结合位点、作用机制通过研究已经掌握;必要的研究及检测工具也在短期内得到开发;易感性研究和开发合适的动物研究模型也在多种属动物体内进行,如雪貂、仓鼠、猫、犬、貉、兔、转基因鼠、猪、猴、禽类及果蝠等。

在进行病毒 RNA 侵袭部位的研究中,发现不同种属间存在一定的差别,如病毒更偏爱感染雪貂的上呼吸道(Upper Respiratory Track, URT), 西伯利亚仓鼠的下呼吸道更容易受到感染,而人及其他非人灵长类的上下呼吸道都是病毒的侵袭部位。到目前为止,几乎所有对病毒感染部位的检测和分析都是通过对 FFPE 切片进行传统免疫组织化学 (IHC) 的方法开展的。然而这种仅基于若干组织切片、而忽视整体组织空间背景的方法,所得信息具有严重人为偏碍、结论片面化的不足是显而易见的。

近来,随着组织透明化技术(Tissue Optical Clearing,TOC)的成熟,利用该技术进行病毒感染相关研究已有多篇报道,说明 TOC 在研究中的优势也越来越获得认知 [1-6]。针对当前仍在全球范围内波及的 SARS-CoV-2 病毒,也有采用 3D 整体成像,将病毒感染可视化的研究文献发表 [7,8]。值得一提的是,鼻腔内存在骨质化的鼻甲结构,在采用 ECi(Ethyl cinnamate)的透明化方案后亦呈现光学透明化,满足光片整体成像对样本的质量要求。



实验流程如图所示,对雪貂进行鼻腔感染。4 天后获取目的组织后,固定、免疫标记并采用 ECi 透明化后,对组织块进行光片 3D 整体成像。


在厚度约为 4-mm 的上呼吸道样本中,在鼻甲腹侧和背侧多处目的区域均可见 SARS-CoV-2 感染 (如下图 2B)。

使用光片整体成像将鼻甲部位 SARS-CoV-2 感染的三维空间分布可视化。(A) 鼻甲组织结构 (> 200 mm3,感染 4 天后取材) 网格边线示意长度为 2 mm (B) 对目的区域内病毒含量进行强度投射,绿色和玫红色分别为不同来源商品化 SARS-CoV 病毒 N 蛋白。标尺 = 1 mm。

在光片成像为获取病毒三维空间分布的宏观数据的基础上,借助共聚焦扫描成像以亚细胞分辨率深入了解,可见 SARS- CoV-2 胞内段 N 蛋白在纤毛细胞和非纤毛细胞内均有存在,并主要在纤毛细胞的尖端形成聚集。

 

(A) 对目的区域 1(ROI 1)中 SARS-CoV-2 感染强度做投射。图像采用 40x/1.1 水浸物镜进行采集。青绿色为样本自发荧光; 绿色标记为 SARS-CoV-2(N 蛋白 1); 玫红色 = SARS-CoV-2(N 蛋白 #2)。标尺分别为 100 µm (宏观) 和 5 µm (细部)。

美天旎光片成像解决方案

美天旎 UltraMicroscope 光片显微镜系列采用当前先进的光片光学系统和成像分析软件,提供针对完整器官大样本卓越的三维立体成像体验,透明化的整只小鼠样本亦不在话下;更有自动化高通量配置,支持多至 5 个样本、多个放大倍率间自由切换且自动聚焦,令图像始终保持锐利边缘的高品质成像,满足后续复杂图像数据分析。

美天旎 MACS Clearing Kit (130-126-719) 是基于 ECi 的高效、易用型组织透明化试剂盒,一种试剂盒满足人和小鼠几乎所有组织器官的透明化处理,流程简单安全无毒;包含的免疫标记缓冲液保证充分的抗体浸润和结合。

本文即采用 ECi 的组织透明化方法并使用 UltraMicroscope 进行成像,发表于 2020 年 10 月。文献标题为:3D reconstruction of SARS-CoV-2 infection in ferrets emphasizes focal infection pattern in the upper respiratory tract。

美天旎 REAfinity 成像用重组抗体经过优化和验证,直接偶联荧光标记物省去二抗标记和相应非特异标记的烦恼,专用于稳定且高信噪比的组织三维免疫标记。

参考文献:

【1】Potratz, M.; Zaeck, L.; Christen, M.; Te Kamp, V.; Klein, A.; Nolden, T.; Freuling, C.M.; Muller, T.; Finke, S. Astrocyte Infection during Rabies Encephalitis Depends on the Virus Strain and Infection Route as Demonstrated by Novel Quantitative 3D Analysis of Cell Tropism. Cells 2020, doi:10.3390/cells9020412.

【2】Zaeck, L.; Potratz, M.; Freuling, C.M.; Muller, T.; Finke, S. High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue. J Vis Exp 2019, 10.3791/59402, doi:10.3791/59402.

【3】Kieffer, C.; Ladinsky, M.S.; Ninh, A.; Galimidi, R.P.; Bjorkman, P.J. Longitudinal imaging of HIV-1 spread in humanized mice with parallel 3D immunofluorescence and electron tomography. Elife 2017, 6, doi:10.7554/eLife.23282.

【4】Potratz, M.; Zaeck, L.M.; Weigel, C.; Klein, A.; Freuling, C.M.; Müller, T.; Finke, S. Neuroglia Infection by Rabies Virus after Anterograde Virus Spread in Peripheral Neurons. bioRxiv 2020, 10.1101/2020.09.20.305078, doi:10.1101/2020.09.20.305078.

【5】Ladinsky, M.S.; Khamaikawin, W.; Jung, Y.; Lin, S.; Lam, J.; An, D.S.; Bjorkman, P.J.; Kieffer, C. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife 2019, 8, doi:10.7554/eLife.46916.

【6】Chhatbar, C.; Detje, C.N.; Grabski, E.; Borst, K.; Spanier, J.; Ghita, L.; Elliott, D.A.; Jordao, M.J.C.; Mueller, N.; Sutton, J., et al. Type I Interferon Receptor Signaling of Neurons and Astrocytes Regulates Microglia Activation during Viral Encephalitis. Cell Rep 2018, 25, 118-129 e114, doi:10.1016/j.celrep.2018.09.003.

【7】Eckermann, M.; Frohn, J.; Reichardt, M.; Osterhoff, M.; Sprung, M.; Westermeier, F.; Tzankov, A.; Werlein, C.; Kuhnel, M.; Jonigk, D., et al. 3D virtual pathohistology of lung tissue from Covid-19 patients based on phase contrast X-ray tomography. Elife 2020, 9, doi:10.7554/eLife.60408.

【8】Li, G.; Fox, S.E.; Summa, B.; Hu, B.; Wenk, C.; Akmatbekov, A.; Harbert, J.L.; Vander Heide, R.S.; Brown, J.Q. Multiscale 3-dimensional pathology findings of COVID-19 diseased lung using high-resolution cleared tissue microscopy.

 
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